Tout savoir sur la fermentation malo-lactique

Par Marie TRAISSAC, ENOSENS-Pôle Œnologique Grézillac

 

Généralités

La fermentation malo lactique (FML) est la transformation de l’acide malique en acide lactique, avec dégagement de CO₂. Cette transformation est catalysée par l’enzyme malolactique, présente dans les bactéries lactiques (fig. 1). Ce phénomène a été mis en évidence dès la fin du 19^ème siècle, mais a été longtemps considéré comme néfaste pour le vin (Pasteur disait « les levures font le vin, les bactéries le détruisent »). Il a été décrit à la fin des années 1940 par Peynaud, et ce n’est que depuis les années 1960 que ce phénomène est (à peu près) maîtrisé.

Figure 1 : Réaction de transformation de l’acide malique en acide lactique

 

On trouve dans le vin en fin de fermentation alcoolique plusieurs espèces de bactéries lactiques : en très grande majorité Oenococcus œni, puis en faible proportion Lactobacillus plantarum, Lactobacillus hilgardii et Pediococcus parvulus. La littérature parle peu de ces 3 dernières espèces, et décrit surtout l’activité d’Oenococcus oeni (figure 2), qui est la bactérie la plus adaptée au milieu hostile qu’est le vin (milieu alcoolique et acide) pour effectuer la FML.

Figure 2 : observation d’Oenococcus oeni au microscope électronique

 

Des souches de Lactobacillus plantarum (figure 3) sont toutefois utilisées depuis quelques années pour effectuer la FML avant ou pendant la fermentation alcoolique. Nous en reparlerons dans le paragraphe consacré à la co-inoculation.

Figure 3 : observation de Lactobacillus plantarum au microscope électronique

 

Conséquences organoleptiques et analytiques de la FML

Chimiquement et gustativement, l’acide malique est un acide plus fort que l’acide lactique. Les conséquences de la FML seront donc : une baisse de l’acidité totale (AT), une augmentation du pH, une sensation d’acidité moindre à la dégustation (acide malique à la saveur dure et verte, acide lactique à la saveur plus suave), et un dégagement de CO₂. En théorie, une baisse de l’acide malique de 1 g/l fait baisser l’acidité totale (AT) de 0,4 g/l, et augmente de 5 à 10% le pH. La FML peut s’accompagner aussi d’une augmentation de l’acidité volatile. On assiste aussi à la production de composés aromatiques plus ou moins bénéfiques (diacétyle et composés apportant des notes soufrées, florales ou toastées), influencée par le contenant dans lequel se déroule la FML (ou trouve généralement plus de composés volatils lorsque la FML se fait en barrique).

Certaines souches de bactéries lactiques produisent des amines biogènes, qui peuvent masquer les arômes, problème évitable par l’utilisation de souches sélectionnées. Ce phénomène est cependant assez peu rencontré.

 

Facteurs favorables et défavorables à la FML

Pour que la FML se déclenche, la population de bactéries lactiques doit atteindre une valeur seuil d’environ 10⁶ UFC/ml, à partir de laquelle les bactéries métabolisent l’acide malique. C’est pourquoi on observe dans la grande majorité des cas un temps de latence entre la fin de la fermentation alcoolique (population en bactéries lactiques = 10² UFC/ml) et le début de la FML, comme le montre la figure 4. Les facteurs défavorables à la FML sont donc en premier lieu des facteurs défavorables à la multiplication des bactéries.

Figure 4 : Schéma de l’évolution de la population en bactéries lactiques pendant la vinification

 

En termes de nutrition, les bactéries lactiques disposent dans le vin en fin de fermentation alcoolique (FA) de suffisamment de sucres comme source de carbone. Les acides aminés présents dans le vin sont source d’azote, et sont apportés en quantité suffisante à la fois par le raisin et par les levures. Les autres facteurs nutritionnels (vitamines, oligo éléments…) présents dans le milieu couvrent de même les besoins des bactéries lactiques. La nutrition des bactéries lactiques n’est donc théoriquement pas un facteur défavorable à la FML. On considère cependant que le milieu est carencé en azote organique lorsque sa concentration est inférieure à 60 mg/L.

Attention : l’azote dont les bactéries ont besoin est de l’azote organique. Il est inutile de rajouter en fin de fermentation alcoolique des nutriments à base d’azote minéral (sulfate ou phosphate d’ammonium) car ils ne seront pas utilisés par les bactéries lactiques, mais ils favoriseront grandement la multiplication de Brettanomyces.

En fin de fermentation alcoolique, les bactéries lactiques sont dans un milieu toxique, contenant de l’éthanol, du SO₂ libre (ajouté à la vendange et produit par les levures) et a fortiori total, et affichant une acidité totale et un pH défavorables à leur croissance et à leur multiplication. On trouve également des acides gras à chaines moyennes (C₁₀, C₁₂, et parfois C₁₈) et leurs esters, et les composés phénoliques dans la liste des ennemis potentiels. La teneur en acide malique est bien sûr à prendre en compte.

La présence de certains microorganismes, plus particulièrement Brettanomyces, est un facteur d’inhibition de la FML.

Le contact avec l’oxygène peut être un facteur limitant dans une moindre mesure : les bactéries lactiques sont anaérobies, mais tolèrent l’oxygène. C’est pourquoi on évite d’écouler un vin en malo sous marc.

Il est important de noter que ces facteurs, résumés dans le tableau 1,  se cumulent, et que leur effet est renforcé par la température. La température optimale de croissance des bactéries lactiques se situe entre 18 et 22°C.

 

Facteurs d’inhibition	Valeurs limitantes
TAV	> 13% vol
pH	< 3,30
SO2 total	> 40 mg/L
Acide L-malique	<1 g/L ou >5 g/L
Acides gras à moyenne chaîne	Acide octanoïque > 25 mg/L Acide décanoïque > 5 mg/L
Brettanomyces	103 cellules/ml
Azote organique	60 mg/L

Tableau 1 : valeurs critiques des facteurs d’inhibition de la FML

Pour pallier à certains de ces effets d’inhibition, le vinificateur aidé de son œnologue conseil dispose d’outils éprouvés :

• L’ajout d’écorces de levures peut amoindrir l’effet inhibiteur des AG à chaîne moyenne (au moins 24 h avant inoculation d’un levain dans le cas d’un ensemencement) ;
• Le collage, la filtration, voire la flash pasteurisation dans les cas extrêmes, pour faire diminuer les populations de Brettanomyces. Il est préférable d’ensemencer sans attendre le vin en bactéries lactiques suite à ces opérations ;
• La désacidification ramenant le vin à un pH favorable ;
• L’ajout d’un nutriment spécifique de la FML, de préférence après avoir vérifié les autres facteurs d’inhibition.

Si la FML ne démarre pas, malgré l’ajout d’écorces de levures, certaines analyses peuvent aider à trouver le ou les facteurs d’inhibition :

• Vérifier la température du vin ;
• Vérifier TAV, AT, pH et acide malique;
• Doser le SO₂ libre et total. Il est à noter que l’utilisation de certains produits œnologiques ajoutés sur vendange et combinant SO₂ et azote, ou SO₂ et tanins, peuvent apporter des doses importantes et néfastes de SO₂. Ces produits sont à proscrire.
• Dénombrement des Brettanomyces par PCR ;
• Observation microscopique pour vérifier la présence des bactéries ;
• Azote organique.

Ces analyses sont aussi, et bien évidemment, préconisées avant un ensemencement en bactéries.

 

Les différentes sortes de bactéries du commerce

Il existe différents processus d’obtention des bactéries lactiques en usine. Une même souche de bactérie peut exister sous plusieurs formes.

• Les bactéries à ensemencement direct(type Viniflora®) : elles sont lyophilisées (conservation à -18°C pendant 2 ans ou +4°C pendant 6 mois) ou congelées (conservation à -50°C). Ce sont les bactéries les plus simples à utiliser, il suffit de les incorporer au vin après les avoir réhydratées éventuellement dans un peu de vin. Les fournisseurs garantissent sur ce type de bactéries le niveau de population seuil pour le déclenchement de la FML. Ces bactéries sont à utiliser sur les vins présentant des conditions les plus favorables à la FML.
• Les bactéries à inoculation directe (type MBR® ou Direct) : elles sont acclimatées aux conditions difficiles du vin en usine, et peuvent être inoculées directement ou être réhydratées dans de l’eau non chlorée quelques minutes. La cuve doit être homogénéisée à l’abri de l’air après inoculation.
• Les bactéries pré acclimatées (type 1-Step® ou PreAc) : elles sont commercialisées avec un activateur spécifique (non autorisé en bio). Elles sont préparées dans un mélange d’eau et de vin à 20°C, puis inoculées dans le vin après 30 minutes à 12 heures selon le contexte (co-inoculation précoce, tardive ou séquentielle).
• Les bactéries dites « standard »: Leur mise en œuvre est longue (plusieurs jours) et assez lourde, cependant elles sont conseillées dans les conditions difficiles ou en cas d’arrêt de FML. Elles doivent être réhydratées dans de l’eau non chlorée, puis réactivées dans un mélange eau/vin, et doivent ensuite se multiplier dans un pied de cuve avant inoculation.

 

La co-inoculation

La co-inoculation consiste à ensemencer le milieu à la fois en bactéries lactiques et en levures, afin d’éviter un temps de latence trop long entre FA et FML. Il est ainsi possible de diminuer le risque microbiologique (notamment Brettanomyces), diminuer les coûts de chauffage, permettre une mise en marché précoce et permettre une entrée précoce en phase d’élevage. L’inoculation dite séquentielle n’est pas une co-inoculation : il s’agit de l’inoculation d’un levain malolactique après fin de FA et écoulage.

Il existe plusieurs types de co-inoculations :

• La co-inoculation hyper précoce sur jus: les bactéries lactiques utilisées sont Lactobacillus plantarum. Elles sont inoculées sur jus, 48 à 72 heures avant levurage, et ne s’attaquent pas aux sucres. Ce type de co-inoculation est conseillé sur des jus à pH élevé (3,6 à 3,9), de préférence en phase liquide ou sur raisins très efficacement foulés car il existe des risques de relargage d’acide malique en fin de FA. Lactobacillus plantarum étant une bactérie sensible à l’alcool (à partir de 5% vol), sa population disparaît peu à peu au cours de la FA. Pour les modalités d’ensemencement, il est préférable de se rapprocher d’un œnologue.
• La co-inoculation précoce: les bactéries lactiques (Oenococcus oeni ou Lactobacillus plantarum) sont inoculées 24 heures après le départ en FA. La FML démarre alors que la FA n’est pas encore achevée, et se termine généralement quelques jours après la FA. Cette technique est fréquemment utilisée sur les vins primeurs mis en marché dès la fin octobre.
• La co-inoculation tardive: le levain malolactique (Oenococcus oeni) est inoculé à partir de 1010 de densité. Les bactéries s’adaptent ainsi au milieu pendant que la FA se termine, et ne démarrent théoriquement la FML qu’une fois la FA achevée.

Quel que soit le type de co-inoculation qu’il veut mettre en œuvre, le vinificateur est confronté à diverses contraintes, la plus importante étant la température. La réussite de la co-inoculation dépend en effet la maîtrise des températures, ce qui implique de posséder une thermorégulation chaud/froid performante, tout choc thermique étant à proscrire. Schématiquement, la température du jus doit être supérieure à 16°C au moment de l’inoculation, et ne doit pas dépasser 25°C. En outre, le moment de l’inoculation doit être raisonné en fonction du sulfitage de la vendange (cf. tableau 2)

Sulfitage	Délai
< 5 g/hl	24 heures
5 à 8 g/hl	48 heures
> 8 g/hl	72 heures

Tableau 2 : délai à respecter entre levurage et inoculation des bactéries lactiques en fonction du sulfitage de la vendange.

 

Par ailleurs, les paramètres du moût (pH, SO₂ libre et SO₂ total, ainsi que le TAV en cas de co-inoculation tardive) doivent être favorables.

Enfin, il est important de choisir une souche de levure peu exigeante en azote afin que le levain malolactique dispose d’une quantité suffisante de nutriments.

La co-inoculation nécessite une surveillance accrue de l’AV et de la teneur en acide malique. Lorsque la FML se termine avant les sucres, il est préférable de sulfiter à 3 g/hl, la volatile ne devant pas monter de plus de 0,1 g/L par jour.

 

Bactéries lactiques indigènes ou du commerce ?

La plupart des études de coût montrent que l’utilisation d’un levain malolactique coûte moins cher que l’utilisation de bactéries indigènes. Ces conclusions sont néanmoins à relativiser sur les chais dans lesquels la FML se fait spontanément et rapidement après la fin de la FA.

Au niveau organoleptique, les bactéries sélectionnées ne produisent pas d’amines biogènes pouvant masquer les arômes. En ce qui concerne les phénols volatils, les bactéries lactiques Oenococcus oeni, indigènes ou du commerce, n’en produisent pas ou très peu dans les conditions du milieu vin. L’apparition récente dans le commerce de souches dites phénols négatives (c’est-à-dire n’étant pas susceptibles de produire des précurseurs de phénols volatils, sources de défauts organoleptiques) ne veut pas dire qu’il existe des souches « phénols positives ».

Conclusion

Même si la FML semble être de moins en moins mystérieuse, elle réserve encore pour les œnologues et les vinificateurs une grande part d’inconnu, et reste encore parfois capricieuse. De nombreuses recherches la concernant sont en cours.

Les œnologues Enosens sauront vous faire partager leurs connaissances et leurs retours d’expérience, et vous aiguiller vers la meilleure stratégie à adopter pour atteindre votre objectif produit et faire face aux problématiques rencontrées lors de la FML. Ils disposent pour cela d’un matériel d’analyse de pointe, et vous proposent, outre les paramètres habituels, le dosage de l’azote organique et le dénombrement des Brettanomyces par PCR. Ils vous aideront ainsi à faire de cette FML une capricieuse apprivoisée.

Sources :

• Les 5 à 7 de Grézillac – La malo : la capricieuse apprivoisée (2014)
• Microbiologie du vin – Bases fondamentales et applications. A. Lonvaud-Funel, V. Renouf, P. Strehaiano. Editions Tec & Doc Lavoisier (2010).
• 101 questions autour de la FML. V. Renouf, V. Moine, M-L Murat et A. Martinez. Laffort (2010).
• Traités d’œnologie, volumes 1 et 2. P. Ribéreau-Gayon, D. Dubourdieu, B. Donèche, A. Lonvaud, Y. Glories, A. Maujean.